Клинические исследования ЖИВОГО КОЛЛАГЕНА на базе ФГБНУ «Федеральный Научный Центр пищевых систем ИМ. В.М. Горбатова Российской Академии наук
Отчет N 034.21.085
«Анализ молекулярно-массового распределения белковых фракций в трех коллагенсодержащих образцах методом одномерного электрофореза»
Пробоподготовка
Для анализа отбирали 100 мг образца и смешивали его с 400 мкл специального лизирующего раствора (состав: 9 М мочевина, 5% β-меркаптоэтанол, 2% тритона Х-100, 2% амфолинов с рН в диапазоне 3–10). Полученный гомогенат затем очищали методом центрифугирования при скорости 14000 об/мин на протяжении 10 минут. После завершения процесса отделяли супернатант. Следующим шагом к полученному супернатанту добавляли белковый буфер в соотношении 1:1. Для приготовления этого буфера в пробирки типа «эппендорф» помещали 1 мл додецилсульфата натрия (SDS) концентрации 10%, 250 мкл высококонцентрированного β-меркаптоэтанола, 625 мкл Трис-HCl 0,5 М, 1,5 г мочевины. Далее добавляли бромфеноловый синий до достижения темной окраски и доводили объем смеси до 5 мл дистиллированной водой. Затем пробы прогревали на кипящей водяной бане в течение 5 минут.
Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле
Для проведения вертикального гель-электрофореза применяли камеру (Хеликон, Россия) и заполняли её 10% полиакриламидным гелем. Сверху на него заливали 6% гель, в котором создавали лунки для добавления образцов. Каждый исследуемый образец помещали в количестве 6 мкл. В качестве буфера использовали раствор, содержащий 25 мМ трис-HCl, 192 мМ глицина и 0,1% SDS. Электрофоретический процесс проводился при следующих параметрах: первые 30 минут — с напряжением 60 В, а затем продолжали при напряжении 120 В до тех пор, пока фронт красителя (бромфеноловый синий) не достигал нижнего края гелевых пластин.
Визуализация и анализ изображений
Окрашивание белков с использованием Кумасси G-250 выполняли в растворе следующего состава: 10% уксусной кислоты, 25% изопропанола и 0,05% Кумасси G-250. Для удаления не связавшегося красителя применяли 10%-ный раствор уксусной кислоты.
Для повышения разрешающей способности дополнительно проводили окрашивание азотнокислым серебром по методике Blum’а.
Для выполнения компьютерной денситометрии использовали одномерные электрофореграммы, находящиеся во влажном состоянии. Полные цифровые изображения получали с помощью сканера Bio-5000 Plus (Serva, Германия) в режиме 600 ppi 2D-RGB. Полученные цифровые изображения редактировали в графическом редакторе.
Результаты
Условные обозначения:
Ст – Стандарт молекулярных масс: 250, 150, 100, 70, 50, 40, 30 кДа (сверху вниз).
Образец 1 – Старая формула
Обнаружено большое количество интенсивно окрашенных белков с молекулярной массой более 50 кДа, наиболее выраженные фракции: 34 кДа, 43 кДа, 47 кДа, 58 кДа, 63 кДа, 70 кДа, 90 кДа и 150 кДа. В соответствии с базой данных Swiss-Prot, вероятно, являющиеся остеонектином, фибромодулином, трансформирующий бета-3 протеин фактора роста, кохлином, цепью коллагена альфа-3 (IX), коллагеновой цепью альфа-2 (IX), эластином, цепью коллагена альфа-1 (IX) и цепью коллагена альфа-1 (XVII).
Образец 2 – Улучшенная формула Первого Живого Коллагена
Обнаружено большое количество интенсивно окрашенных белков во всем диапазоне молекулярных масс, наиболее выраженные фракции: 23 кДа, 30-31 кДа, 35 кДа, 38 кДа и широкий спектр белков от 20 кДа до 270 кДа. В соответствии с базой данных Swiss-Prot, вероятно, являющиеся пептидил-пролил цис-транс-изомеразой B, коллектином-10, белком, связанным с хрящом, остеонектином, белком хрящевого матрикса, цепью коллагена альфа-3 (IX), коллагеновой цепью альфа-2 (IX), эластином, цепью коллагена альфа-1 (IX) и цепью коллагена альфа-1 (XVII).
Образец 3 – Сторонний образец
Отмечено небольшое количество слабовыраженных фракций в 44 кДа, 50 кДа, 70 кДа, 85 кДа, 110 кДа. Наиболее интенсивно окрашенные белки были обнаружены в области более 230 кДа, в соответствии с базой данных Swiss-Prot, вероятно, являющиеся альфа-текторином, цепью коллагена альфа-3 (VI), цепью коллагена альфа-1 (XII) и фибронектином.
